Methods: Primary cell cultures of epithelial keratinocytes and stromal fibroblasts were generated by enzymatic treatment of normal oral mucosa biopsies. To develop an oral mucosa substitute by tissue engineering, oral fibroblasts were cultured in a stroma substitute made of human fibrin and agarose. After polymerization of the bioengineered stroma, human keratinocytes were seeded on the surface of the construct. Primary antibodies used in the immunohistochemical study included anti –CK5 to CK19. Total RNA corresponding to the oral constructs was extracted and analysed to evaluate the comprehensive gene expression by using Affymetrix U133-plus 2.0 microarray chips. All experiments were synchronically performed in the oral substitutes and in native control tissues.
Results: Histological analysis of the artificial tissues showed high similarities with normal oral mucosa controls. Non-stratified tissues expressed higher amounts of genes with a role in protein synthesis and signal transduction but only a low number of cytokeratins (only CK13). Mature artificial oral mucosa expressed significantly higher amounts of RNA corresponding to genes related to stratification, differentiation and development and also a high number of cytokeratins (CK 5/6, 10, 19).
Conclusions: These results suggest that in our model of artificial oral mucosa there is a good correlation between genetic and immunohistochemical patterns in the tissue engineering protocols we developed.
Supported by FIS PI080615
Objetivos: La evaluación de tejidos artificiales desarrollados por ingeniería tisular en el laboratorio es fundamental antes de que estos puedan ser usados en pacientes. En este trabajo nosotros hemos realizado una evaluación inmuhistoquímica y genética de nuestro modelo de mucosa oral de fibrina agarosa generado por ingeniería tisular.
Métodos: Se obtuvieron cultivos primarios de queratinocitos y fibroblastos estromales de biopsias de mucosa oral normal humana mediante un tratamiento enzimático. Para desarrollar substitutos de mucosa oral por ingeniería tisular, los fibroblastos fueron cultivados en un estroma construído con fibrina humana y agarosa. Después de la gelificación del estroma, queratinocitos humanos fueron colocados en la superficie del substituto estromal. Para el estudio inmunohistoquímico se usaron los anticuerpos primarios anti –CK5 a CK19. El ARN total, correspondiente a los substitutos orales, fue extraído y para evaluar la expresión genética se utilizó Affymetrix U133-plus 2.0 microarray chips. Todos los experimentos fueron sincrónicamente realizados en substitutos orales y en controles tisulares naturales.
Resultados: El análisis histológico de tejidos artificiales mostró similitudes con el control de mucosa oral normal. Los tejidos no estratificados mostraron niveles mas elevados de expresión de genes vinculados a la síntesis de proteínas y señales de transducción aunque también mostraron un bajo número de citoqueratinas (solamente CK13). La mucosa oral artificial madura expresó cantidades significativamente mas altas de ARN correspondientes a genes relacionados con la estratificación, diferenciación y desarrollo y también un alto número de citoqueratinas (CK5/6, 10, 19).
Conclusiones: Estos resultados sugieren que en nuestro modelo artificial de mucosa oral se alcanza una buena correlación entre patrones inmunohistoquímicos y genéticos en los protocolos de ingeniería de tejidos que nosotros desarrollamos.
Financiado FIS PI080615